LifeSensors丨艾美捷MG780：分子胶体外泛素化实验试剂盒的原理与应用

背景知识

泛素及其连接机制

泛素是一种小分子多肽，能够通过其C末端与目标蛋白上的赖氨酸残基的氨基发生共价结合，这一过程被称为单泛素化。此外，还可以通过泛素分子上存在的七个赖氨酸残基中的任何一个，将更多的泛素分子连接到初始泛素上，形成泛素链，这一过程被称为多泛素化。其中，通过泛素分子上第48位赖氨酸（K48）形成的泛素链是最为人们所熟知的。单泛素化已被证明可以改变目标蛋白的定位、活性和/或功能。而多泛素化最常见的结果是通过蛋白酶体介导的目标蛋白降解。

泛素与目标蛋白的结合需要三种不同酶的协同作用，即E1（泛素激活酶）、E2（泛素结合酶）和E3（泛素连接酶），最终在泛素的C末端与目标蛋白上的赖氨酸残基的ε-氨基之间形成异肽键。泛素E3连接酶作为支架蛋白，为泛素结合酶（E2）和目标底物提供结合位点。通常情况下，E3连接酶介导泛素从E2硫酯中间体转移到目标蛋白的酰胺键上。除了对底物进行泛素化外，E3连接酶还可以自身泛素化。艾美捷作为LifeSensors的DJ代理商，将详细介绍：

分子胶（Molecular Glue）

分子胶（蛋白质降解靶向嵌合分子）通过人为地劫持泛素蛋白酶体系统（UPS）的组分来降解目标蛋白。分子胶药物是单价小分子，能够与E3连接酶结合，使其能够泛素化一个新的底物或目标蛋白。理论上，将这两个实体拉近会导致目标蛋白的多泛素化和蛋白酶体降解。然而，鉴于这种情况的复杂性，并不总是如预期那样发生，分子胶的发现策略面临着许多挑战和陷阱。目前的实验方法解决了许多这些挑战，并作为一种工具，通过监测分子胶介导的泛素化来有效报告真正的分子胶效率。

适用范围

体外泛素化试剂盒旨在建立一种高通量方法，通过监测目标蛋白的内在泛素化能力，准确预测分子胶的效率。我们提供针对三种E3泛素连接酶（Cereblon、VHL和HDM2）的试剂盒，用于监测分子胶介导的泛素化，以选择目标蛋白。

实验原理

使用预先涂有专有TUBE试剂的微量滴定板条（实验板）来捕获分子胶依赖反应中形成的多泛素链。在实验中，分子胶与E3连接酶和目标蛋白（未包含）一起孵育，以促进三元复合物的形成。接下来，加入含有泛素和ATP的E1-E2酶混合物以启动分子胶介导的泛素化。由E1-E2-E3-分子胶-目标蛋白机制产生的多泛素链被捕获在孔中，经过洗涤后，使用针对目标蛋白（未包含）的抗体和与HRP（包含）结合的二抗通过化学发光进行检测。因此，这种类似“三明治”ELISA的实验中产生的信号是分子胶活性的定量测量。

LifeSensors 分子胶体外泛素化实验试剂盒优势：

1. 在高通量筛选（HTS）格式下，通过监测泛素化来监测分子胶活性，选择您感兴趣的目标蛋白。

2. 同时筛选多种分子胶变体。

3. 准确建立排序效力，指导药物化学家进行可靠的结构活性关系（SAR）研究。

4. 通过合理设计依赖于功能性实验的分子胶，这些实验报告蛋白质的“泛素化潜力”，加速分子胶药物的发现和临床开发。

5. 该检测策略不需要对泛素进行非天然标记或标记，这可能导致实验伪影。

建议用途

1. 测试和比较多种分子胶的活性，并建立与DC50的相关性。

2. 比较分子胶与CRBN或其他E3连接酶的活性。

3. 测试分子胶目标蛋白的特异性和亚型选择性。

试剂盒组成

1. 体外泛素化实验板

- 注意：不要将实验板快速解冻至室温。建议将实验板在4°C下放置30分钟，然后再转移到室温。

2. 实验缓冲液（10倍）–1 x 1.2 mL

- 重要提示：在1倍实验缓冲液中加入β-巯基乙醇，使其最终浓度达到1 mM。

3. E3混合液（20倍）–1 x 250 uL

4. E1-E2-泛素混合液（20倍）–1 x 250 uL

5. 二抗（抗小鼠或抗兔HRP结合物，100倍）–1 x 60uL

6. 检测试剂DR1和DR2（2倍）–1 x 1 mL过氧化氢和1 x 1 mL鲁米诺

7. 封闭浓缩液（5倍）–1 x 5 mL

8. 阳性对照试剂：

- 生物素-多泛素链（20倍）：1 x 25 uL

- 链霉亲和素HRP（100倍）：1 x 10 uL

储存和稳定性

将所有材料储存于-80ºC。避免多次冻融循环。如果在适当的温度下储存，所有组分至少稳定6个月。

更多分子胶体外泛素化实验试剂盒信息，详询LifeSensors DJ代理商艾美捷科技。